Biblioteka od czasu swojego powstania gromadzi dzieła z zakresu nauk humanistycznych i przyrodniczych. Dzięki prowadzonej od 1873 r. wymianie, zgromadziła unikatowy zasób polskich i zagranicznych wydawnictw naukowych XIX-XXI w. obejmujący m.in. czasopisma gromadzone nieprzerwanie od pierwszych, XIX-wiecznych roczników wydawnictw najważniejszych instytucji naukowych, m.in. Österreichische Akademie der Wissenschaften i francuskiej Académie des Sciences. Wśród zbiorów Biblioteki znajduje się także kompletny zasób wydawnictw wszystkich naszych macierzystych instytucji: Towarzystwa Naukowego Krakowskiego, Akademii Umiejętności, Polskiej Akademii Umiejętności oraz krakowskiego oddziału Polskiej Akademii Nauk.

Hojne dary naszych członków i członków-korespondentów, jak chociażby Ignacego Domeyki, pozwoliły nam także na zgromadzenie unikatowych, nierzadko niedostępnych nigdzie indziej w Polsce monografii ze wszystkich dziedzin wiedzy. Także obecnie otrzymujemy od naszych Czytelników wiele darów, wśród których poczesne miejsce zajmują dzieła pisane w oparciu o nasze zbiory.

Prócz tego, Biblioteka, która do 1918 r. pełniła rolę ogólnopolskiej książnicy ponadzaborowej, posiada kolekcję XIX-wiecznych poloników: pierwszych wydań klasyki polskiej literatury oraz dzieł naukowych.

Aktualnie (stan na koniec 2017 r.) Biblioteka posiada 213 345 wol. wydawnictw zawartych i 347 512 wol. wydawnictw ciągłych.