Zbiór rękopisów Biblioteki Naukowej PAU i PAN w Krakowie liczy obecnie ponad 15 863 jednostek rękopiśmiennych (stan na koniec 2016). Gromadzony jest od r. 1856, tj. od momentu usamodzielnienia się Towarzystwa Naukowego Krakowskiego od Uniwersytetu Jagiellońskiego. Zbiór tworzą głównie dary członków Towarzystwa Naukowego Krakowskiego i Akademii Umiejętności (od 1918 r. Polskiej Akademii Umiejętności) oraz licznych prywatnych ofiarodawców ze wszystkich trzech zaborów i z emigracji. Systematycznie uzupełniany też był na drodze zakupów antykwarycznych.
Zbiór zapoczątkowały kolekcje rękopisów, których twórcami byli: Jan Wincenty Smoniewski, Cyprian Walewski, Antoni Julian Schneider, Ambroży Grabowski, Bolesław Ulanowski, Jan Ambroży Wadowski, Hieronim Łopaciński, Franciszek Wolański czy rodzina Popielów z Czapli Wielkich. Od połowy XIX w. obficie napływały do Biblioteki spuścizny uczonych, literatów, polityków, artystów, a także archiwalia rodzinne i rodowe. Z większych nabytków wymienić należy spuścizny: Joachima Lelewela, Jana Chrzciciela Albertrandy, Jerzego Samuela Bandtkie, Teofila Lenartowicza, Antoniego Zygmunta Helcla, Józefa Majera, Oskara Kolberga, Kazimierza Girtlera, Józefa Hieronima Retingera, Jana Fijałka, Zygmunta Lasockiego, Bronisława Piłsudskiego, Jana Łosia oraz archiwa rodzinne: Chodkiewiczów, Koźmianów, Ogińskich, Potockich, Pusłowskich, Rzewuskich. Ważne miejsce w zbiorach rękopisów zajmują odpisy materiałów dotyczących Polski z archiwów i bibliotek zagranicznych oraz krajowych, sporządzane z inicjatywy AU na przełomie XIX i XX w. Nieocenioną wartość mają odpisy z nieistniejących już dziś rękopisów m.in. akta sejmikowe ziemi liwskiej, nurskiej, rożańskiej, dobrzyńskiej i innych zgromadzone w tzw. Tekach Pawińskiego, materiały dotyczące powstań listopadowego i styczniowego oraz dziejów Księstwa Warszawskiego zebrane w Tekach Staszewskiego, materiały dotyczące działalności Stronnictwa Narodowego zgromadzone w Tekach Zielińskiego, a także ogromny dorobek Ekspedycji Rzymskich AU/PAU zebrany w tzw. Tekach Rzymskich.
Najnowsze nabytki stanowią spuścizny: Wawrzyńca Dayczaka i Marii Dayczak-Domanasiewicz, Leszka Dutki, Jerzego Gota, Jerzego Świecimskiego, archiwum rodziny Żulińskich, przekazane przez Annę Żulińską-Dutka oraz kolekcja filatelistyczna z okresu stanu wojennego, ofiarowana przez Bożenę Wyrozumską.
Osobny zbiór stanowią dyplomy pergaminowe i papierowe, pochodzące od wielu darczyńców, poczynając od daru Bogumiła Gebhardta z 1859 r. Wyodrębniony przez Jana Czubka w latach 1906-1912 w trakcie opracowywania katalogu drukowanego zbiór dyplomów liczył 330 jednostek. Potem został uzupełniony m.in. darami Franciszka Ksawerego Wolańskiego, Jana Ambrożego Wadowskiego, Jana Fijałka. Obecnie liczy 627 jednostek.
W Bibliotece znajduje się obecnie ponad 17 000 dzieł wydanych w XV-XVIII w. Większość z nich pochodzi z darów uczonych i kolekcjonerów. Są to m.in. zbiory Jana Wincentego Smoniewskiego, Juliana Bayera, Floriana Sawiczewskiego, Cypriana Walewskiego, Maksymiliana Marszałkowicza. Dzięki takiej proweniencji do biblioteki trafiły cenne, niejednokrotnie wręcz unikatowe egzemplarze starych druków z polskich i zagranicznych oficyn.
Większość z nich stanowią dzieła naukowe z zakresu nauk humanistycznych i matematyczno-przyrodniczych. Uzupełnia je bogata kolekcja książek o sztuce: traktatów architektonicznych, biografii artystycznych oraz dzieł z zakresu XVIII-wiecznego starożytnictwa i prahistorii sztuki. Prócz tego w kolekcji Biblioteki poczesne miejsce zajmują dzieła teologiczne, liturgiczne i dewocyjne. Interesujące są też zbiory konstytucji sejmowych z XVI-XVIII w., druków urzędowych i ulotnych, w tym unikatowa kolekcja XVIII-wiecznych polskich polemik politycznych stanowiąca źródło do badań ostatnich lat Rzeczypospolitej. Na uwagę zasługuje niewielki, ale ciekawy zespół druków zawiązanych z odsieczą wiedeńską, liczne staropolskie mowy pogrzebowe i kazania żałobne, a także kolekcja scandinavianów przekazanych Bibliotece przez sztokholmskiego antykwariusza Henryka Bukowskiego obejmująca dzieła z zakresu historii i kultury Półwyspu Skandynawskiego.
Perłą kolekcji Biblioteki jest zbiór 155 inkunabułów, które szczegółowo opisano w wydanym w 2015 r. katalogu. W większości pochodzą one z biblioteki krakowskiego klasztoru kanoników regularnych i z tego powodu przeważają wśród nich dzieła o tematyce teologicznej, filozoficznej i religijnej.
Zbiór kartograficzny Biblioteki Naukowej PAU i PAN w Krakowie liczy łącznie 12 221 atlasów, map i planów, o bardzo zróżnicowanej tematyce od map historycznych po najnowsze opracowania.
W zespole kartograficznym znajdują się słynne i cenne atlasy, pochodzące z XVI w. autorstwa najsłynniejszych nowożytnych kartografów, m.in. Abrahama Orteliusa i Gerarda Mercatora, jak też mapy autorstwa Jodoka Hondiusa, Matthäusa Meriana, Erika Dahlberga, Guillauma le Vasseur de Beauplana, Tobiasa Mayera. Na uwagę zasługuje zespół map województw Rzeczypospolitej wykonanych przez Karola Perthéesa na zlecenie Stanisława Augusta Poniatowskiego, jak też opracowana przez Giovanniego Rizzi-Zannoniego Carte de Pologne, wydana nakładem Józefa Aleksandra Jabłonowskiego w przeddzień pierwszego rozbioru Polski. Wśród map XVIII-wiecznych zachował się unikatowy egzemplarz dwubarwnej mapy odbitej na płótnie: Neue Landcharte des Koenigreichs Pohlen, Grosherzogthums Lithauen, und des Koenigreichs, und Herzogthums Westpreussen z 1775 r. oraz jeden z trzech zachowanych na świecie egzemplarzy Carte d'Amerique divisée en ses principaux pays Jeana Cloueta z wydania paryskiego z 1785 r.
Wśród wydawnictw XIX-wiecznych na uwagę zasługują mapy ziem dawnej Rzeczypospolitej, w tym opracowana przez Stanisława Staszica Carta geologica totius Poloniae z 1806 r., Atlas statystyczny Polski Stanisława Platera wydany w Poznaniu w 1827 r. czy mapy historyczne Joachima Lelewela. Wiele dzieł polskich geografów powstało dzięki aktywności emigrantów. Towarzystwu Naukowemu Krakowskiemu i później Akademii Umiejętności ofiarowywali swoje prace m.in. Ignacy Domeyko czy Wojciech Chrzanowski. Wspomnieć też trzeba o Atlasie Geologicznym Galicji, powstałym pod patronatem Akademii Umiejętności w latach 1887-1912. Kolekcję dopełniają liczne plany Krakowa dokumentujące rozwój miasta w XIX i XX w.
Wśród dzieł XX-wiecznych wyróżnia się zbiór wieloarkuszowych map topograficznych Stanów Zjednoczonych, wydawanych przez U.S. Geological Survey w latach 1885-1945 oraz map geologicznych Kanady, wydawanych przez Geological Survey of Canada w latach 1978-1980. Biblioteka posiada ponadto 3 egzemplarze Monumenta Poloniae Cartographica, opracowane przez Karola Buczka i wydane nakładem PAU w Krakowie w 1939 r. Cały nakład tego wydania, poza kilkoma ocalałymi egzemplarzami, został zniszczony przez okupanta niemieckiego.
Mikrofilmowanie zabezpieczające zbiorów rękopiśmiennych zapoczątkowała Biblioteka Narodowa w latach 70-tych ubiegłego wieku. Efektem tych prac są kopie mikrofilmowe ponad 4760 jednostek przechowywanych w zbiorach Biblioteki Naukowej PAU i PAN w Krakowie i Biblioteki Narodowej. Przewodnikiem po tych zbiorach jest Katalog mikrofilmów. Rękopisy Biblioteki PAN w Krakowie, cz. 1, oprac. J. Dużyk, B. Schnaydrowa, J. Staszel, Warszawa 1976 oraz cz. 2, oprac. J. Dużyk, J. Kręcina, Warszawa 1995. Od połowy lat 90-tych XX wieku Biblioteka mikrofilmuje zbiory rękopiśmienne we własnej Pracowni Reprograficznej. Obecnie Biblioteka posiada kopie mikrofilmowe najstarszej części zasobów rękopiśmiennych oraz najpopularniejszych kolekcji odpisów materiałów rękopiśmiennych dotyczących Polski, zebranych w Tekach Pawińskiego, Tekach Rzymskich, Tekach Zielińskiego i innych. Dzięki prowadzonym systematycznie pracom nad zmikrofilmowaniem całej kolekcji rękopisów aktualnie dostępne są mikrofilmowe kopie rękopisów sygn. 1-6042 oraz sygn. 7781-8225 (Teki Zielińskiego), 8318-8356 (Teki Pawińskiego), 8357-8564 (Teki Rzymskie). Biblioteka dysponuje także kompletem mikrofilmów z akt stanów Prus Królewskich. Obecnie zbiór ten zawiera 2 739 mikrofilmów pozytywowych i 624 mikrofilmów negatywowych.